Pilocarpus Vahl é um gênero neotropical com ampla distribuição na América Central e do Sul, no Brasil são registradas 15 espécies sendo 11 endêmicas. É um grupo que despertou grande interesse econômico devido suas propriedades medicinais, pois é a única fonte natural da pilocarpina, um alcaloide utilizado para o tratamento do glaucoma. Entretanto, devido o intenso extrativismo para a obtenção deste alcaloide, as espécies do grupo foram incluídas em listas de espécies ameaçadas. Atualmente os marcadores moleculares ISSR são uma das ferramentas biotecnológicas mais utilizadas para fornecer dados de variabilidade que visam definir estratégias de conservação. Desta forma, objetivou-se avaliar a diversidade genética em populações naturais de Pilocarpus utilizando marcador molecular ISSR. Foram amostradas cinco populações das comunidades: Juá de Vieira, Saco (Pilocarpus jaborandi) em Viçosa-CE e Baixão do Murici (Pilocarpus pauciflorus), Centro de Ramos e Saco (Pilocarpus microphyllus) em Barra do Corda. Utilizou-se 8 primers ISSR (UBC-807, UBC-810, UBC-812, UBC-813, UBC-821, UBC-824, UBC-825 e UBC-856) e a partir dos dados gerados, foram estimados a porcentagem de polimorfismo e a similaridade intra e inter populacional. Os oito primers utilizados geraram 81 marcas, dos quais todas foram polimórficas, com as porcentagens de polimorfismos variando de 19,64% a 33,04% entre as populações. Valores médios do Índice de Diversidade de Shannon (I), Heterozigozidade Esperada (He) foram baixos para as populações estudadas (0,131 e 0,086) e as taxas de polimorfismo foram maiores (33,04%) para as populações das comunidades Juá de Vieira e Saco (P. jaborandi). Já as populações de Centro de Ramos, Sumauma da Mata (P. microphyllus) e Baixão do Murici (Pilocarpus pauciflorus) apresentaram os menores índices de diversidade. A Análise de Variância Molecular (AMOVA) evidenciou que 69% da variabilidade encontram-se entre as populações, com 31% presente dentro das mesmas. Os valores de PhiPT (PhiPT = 0,688) em teste de permutação com 999 replicações mostram resultados significativamente ao nível de P ≥ 0,001 para todos os pares de populações. O valor do Índice de Fixação próximo de 1 indicaram uma grande estruturação das populações, ocasionado pelo isolamento geográfico e perda do fluxo genético entre as áreas, confirmado a partir dos dados obtidos na AMOVA. O teste de Mantel mostrou que não há correlação entre distância geográfica e distância genética (Nei) entre os pares de populações. Análises de Coordenadas Principais (PCoA) usando a matriz de distância de Nei mostrou a formação de cinco grupos, onde as populações PJ-Juá e PJ-Saco foram mais distintas das demais. Os dados Bayesianos de estruturação genética mostraram melhor resultado para quatro grupos, e as populações de PM-Centro e PM-Sumauma (P. microphyllys) mais próximas geneticamente formara um único grupo. Desta forma, os resultados mostraram que as espécies de P. microphyllus e P. pauciflorus se apresentaram menos diversas que as populações de P. jaborandi. Essa diferença pode ser devido ao extrativismo intenso na região de Barra do Corda. Desta forma, são necessárias medidas que aumentem o fluxo gênico entre as populações que se apresentam isoladas a fim de aumentar a variabilidade nessas regiões.