O Brasil destaca-se por conter uma das maiores diversidades de espécies de plantas do mundo, as quais produzem substâncias com propriedades ainda desconhecidas. Dentre as substâncias produzidas pelas plantas, destacam-se os óleos essenciais, os quais possuem diversas propriedades biológicas que tem gerado bastante interesse da indústria farmacêutica, tais como atividade antioxidante, antinflamatória, analgésica, antimicrobiana, atividade antitumoral, entre outras. O presente estudo tem como objetivo identificar quimicamente compostos do óleo essencial de Pilocarpus microphyllus, bem como avaliar a atividade antibacteriana desse composto em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, além de avaliar o potencial citotoxico do óleo essencial em células tumorais humanas in vitro, avaliar o potencial antioxidante. Para isso, foi feita a extração do óleo essencial de Pilocarpus microphyllus por meio da técnica de arraste a vapor. Em seguida, realizou-se a caracterização química do óleo por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) que mostraram três picos majoritários, identificados como sendo: trans-cariofileno, γ-cadileno e tridecanona. As análises da atividade antibacteriana foram feitas observando-se a concentração inibitória mínima (CIM) por meio do halo formado ao redor dos poços conferindo assim a presença ou ausência de atividade antibacteriana, onde se observou a não atividade para a concentração testada (20 μg/mL). Para avaliação do potencial antitumoral do óleo in vitro foram utilizadas quatro linhagens de células tumorais humanas, nas quais foi observada presença de atividade antitumoral, SF-295 (glioblastoma) com CI50 de 24,5 μg/mL, K-562 (leucemia mielóide crônica) com CI50 de 24,3 μg/mL, PC-3 (adenocarcinoma de próstata) com IC50 de 27,8 μg/mL e HCT-116 (carcinoma colorretal) com CI50 de 28,4 μg/mL. A atividade antioxidante foi determinada pelo método DPPH, onde se pode perceber o que o óleo apresentou potencial antioxidante.