As protozooses são um problema de saúde pública mundial, especialmente em países de terceiro mundo, onde cerca de 15% da população mundial estão sob risco de serem infectadas. Nesse contexto as leishmanioses são doenças infecto-parasitárias tendo como agente etiológico mais de vinte espécies de parasitas do gênero Leishmania. Amplamente distribuída, a doença atinge por volta de 88% dos países e atualmente, 12 milhões de pessoas estão infectadas e cerca de 1 a 2 milhões de novos casos surgem a cada ano. Os tratamentos convencionais são onerosos, limitados e possuem uma gama de efeitos colaterais. Produtos naturais vêm sendo investigados de forma massiva para o combate aos dissabores causados por estas enfermidades. Neonothopanus gardneri Berk. ex Gardner é o maior fungo bioluminescente do Brasil e um dos maiores do mundo, sendo amplamente distribuído nas regiões Norte e Nordeste do território nacional. Este estudo teve como objetivo realizar screening fitoquímico bem como explorar o potencial antileishmania, citotóxico e imunomodulador em células de mamíferos, dos extrados e isolados obtidos de N. gardneri. A análise fitoquímica revelou a presença predominante de alcaloides, açúcares redutores, taninos e depsídeos. Os extratos e isolados de N. gardneri demonstraram significativo potencial antileishmania, inibindo o crescimento de formas promastigotas de Leishmania amazonensis e provocando morte das formas amastigotas axênicas em cerca de 100% na concentração de 800 µg/mL para os isolados Subfração 2-éter; Subfração 1, n-butanol e Fração 1- acetato de etila, apresentando resultados de CI50 de 17,099; 40,727 e 68,204 µg/mL, respectivamente. Os extratos e isolados também apresentaram redução na viabilidade celular de macrófagos peritoneais murinos e eritrócitos de carneiro, como também promissora atividade imunomodulatória aumentando a capacidade fagocítica, volume lisossomal e induzindo a síntese de óxido nítrico. N. gardneri demonstrou potencial atividade antileishmania in vitro e imunomodulatória, sendo este estudo, portanto, o pioneiro na investigação das possíveis propriedades biológicas deste fungo. Explorações futuras devem ser feitas para elucidar seus mecanismos de ação, bem como avaliar seu potencial terapêutico em modelos experimentais.