A anfotericina B (AmB) é um fármaco de amplo espectro antifúngico, utilizado no tratamento de inúmeras infecções fúngicas sistêmicas. Não obstante, a administração através das formulações convencionais disponíveis clinicamente causa diversoseventos adversos, restringindo seu uso e reduzindo a eficácia terapêutica. Os carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN), devido às suas propriedades físico-químicas e biológicas, são capazes de proteger ativos da degradação e, ao mesmo tempo, controlar sua liberação no sítio de ação, diminuindo, com isso, a toxicidade. Nesse sentido, este estudo teve como objetivo principal a obtenção, caracterização e avaliação antifúngica in vitro deCLNcontendo anfotericina B. As formulações foram obtidas pelo método de emulsificaçãoà quente eultrasonicação, sendo otimizadas através de um planejamento fatorial 23. Os CLNs foram caracterizados através dos ensaios de diâmetro médio de partícula, índice de polidispersão (IPd) e potencial zeta por espalhamento dinâmico de luz (DLS), eficiência de encapsulação e estudo dos estados agregados de AmB por espectrofotometria UV-VIS, espectrocospiade infravermelho (FT-IR), estabilidade ao longo do tempo e calorimetria exploratória diferencial (DSC). A atividade antifúngica in vitrofoi testada contra estirpe deCandidaalbicans, utilizandoplacasdemicrodiluição, nas concentrações de 100–1,56μg/mL de AmB livre, CLN e CLN-AmB. OsCLNs desenvolvidos apresentaram diâmetro inferior a 179 nm, IPd menor que 0,4 e adequado potencial zeta, sendo estáveis durante 30 dias. A eficiência de encapsulação atingiu valores próximos à 100%, e os estudos de FT-IR e DSC corroboraram um encapsulamento mecânico da AmB. O grau de agregação da AmB no CLN foi superior à solução de AmBmicelar disponível comercialmente, comprovando a redução da toxicidade da formulação. A avaliação antifúngica indicou que CLN-AmBatingiuuma MIC (50 μg/mL) menor que a AmB livre. Isto pode terocorrido devidoà liberação sustentada de AmB da matriz lipídica e pela liberação do fármaco em estado de maior agregação. Dessa forma, os resultados demonstraram que o CLN desenvolvido é um sistema relevante para o encapsulamento da AmB com potencial para futura terapia de doenças infecciosas causadas por cepas resistentes de C. albicans.