Banca de QUALIFICAÇÃO: MARLENE SIPAUBA DE OLIVEIRA
Uma banca de QUALIFICAÇÃO de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.DISCENTE: MARLENE SIPAUBA DE OLIVEIRA
DATA: 20/12/2018
HORA: 08:00
LOCAL: Auditório do LASAN CCA UFPI
TÍTULO: USO DO ACP® NA PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES CAPRINOS
PALAVRAS-CHAVES: ACP, Criopreservação de oócitos. caprinos
PÁGINAS: 45
GRANDE ÁREA: Ciências Agrárias
ÁREA: Medicina Veterinária
SUBÁREA: Reprodução Animal
ESPECIALIDADE: Ginecologia e Andrologia Animal
RESUMO:
A caprinocultura tem aumentado de forma significativa sua participação no cenário agropecuário brasileiro, principalmente pelo fato de ser uma importante alternativa para desenvolvimento da pecuária na região semiárida do Nordeste, porém ainda sem um manejo que possa melhorar sua produção. Apesar de possuir um efetivo considerável, o Nordeste adota predominantemente o sistema de criação extensivo, com técnicas rudimentares de produção e reprodução notadamente caracterizada de subsistência, resultando em baixo valor genético dos animais produzidos, permitindo poucos avanços do setor na região (ROCHA, 2009). Contudo se faz necessário o uso de biotecnologias de ponta aplicadas à reprodução animal, técnicas capazes de promover resultados amplos e rápidos em programas de melhoramento genético nos rebanhos, como também de conservação de material genético de animais superiores e de espécies ameaçadas ou em risco de extinção e atuação direta na obtenção de maior número de animais de elevada qualidade. O objetivo deste estudo é avaliar o uso do ACP® na produção in vitro de embriões caprinos, observando todos os processos que compreende desde a recuperação dos oócitos, criopreservação, descongelamento, maturação, fertilização e cultivo. O experimento está sendo executado no Laboratório de Biotecnologias da Reprodução Animal da Universidade Federal do Piauí, Campus Petrônio Portela, Teresina, Piauí, Brasil. No total Serão utilizados ovários provenientes de cabras púberes sem padrão racial definido (SRD) oriundos de abatedouros locais da região metropolitana de Teresina-PI. Após o abate, os ovários colhidos são transportados imediatamente ao laboratório em garrafa térmica contendo solução salina fisiológica (NaCl 0,9%) aquecida a 37°C acrescida de 30μg/mL de sulfato de gentamicina em um período máximo de 2 (duas) horas. Ao laboratório, os ovários são imediatamente imersos em solução fisiológica aquecida (37ºC) em banho-maria, durante todo o período de punção. As aspirações são realizadas através de bomba a vácuo (Aspirador Cirúrgico AspiraMax® – NS, MA520-60, São Paulo, Brasil). O aspirado será diretamente colocado em tubos tipo falcon de 15 mL e após o período de decantação de 15 minutos o sedimento é aspirado através de pipeta e depositado em placas de Petri com solução de DPBS, aquecida previamente em placa aquecedora com temperatura de 37°C, para a identificação e classificação das estruturas oocitárias, as quais são transferidas para placas de Petri de 35 x 10 mm. Os oócitos são avaliados e classificados de acordo com sua qualidade adaptado de LEIBFRIED e FIRST (1979) em estereomicroscópio, sob aumentos de 10X e 40X. Os oócitos recuperados, são estabilizados em 3 gotas de 200μL de: Etilenoglicol a 0,5; 1,0 e 1,5 M por 5 minutos para cada gota e as células de cumulus são concentrada por centrifugação em tubos cônicos de microcentrífuga de 0,5mL juntamente com etilenoglicol a 1,5 M e ACP®(de acordo com o fabricante). Posteriormente ao equilíbrio os oócitos e as células são envasados. Os oócitos em grupos de 05 (cinco) em palhetas de 0,25 mL com crioprotetor Etilenoglicol a 1,5 M + ACP® entre duas colunas ACP®. A criopreservação dos oócitos e células do cumulus são realizadas pelo método de congelação lenta, em máquina de congelação programável (TK 3000®, TK Tec. Congel. LTDA, Uberaba, MG, Brasil) e, posteriormente, armazenadas em botijão criogênico. O descongelamento (obedecerá a sequência inversa ao equilíbrio para congelação). Em seguida os oócitos serão, banhados em meio de seleção oocitária composto por TCM-199, suplementado com 2,2 mg de bicarbonato de sódio, 0,2 mM de piruvato, 1% de sulfato de gentamicina e 10% de soro fetal bovino (SFB) para, serem direcionados à MIV. O total de oócitos selecionados foi igualmente dividido em quatro grupos de maturação, onde os Grupos 1 e 2 serão imersos em meio composto de TCM-199, suplementado com 2,2 mg de bicarbonato de sódio, 20 µg/mL de FSH/ LH, 10 ng/mL de EGF e 10%(v/v) de SOE, acrescidos ou não de células do cumulus. Já os Grupos 3 e 4 utilizarão meio composto por TCM-199, suplementado com 2,2 mg de bicarbonato de sódio, 0,2 mM de piruvato, 1% de sulfato de gentamicina e 10% de soro fetal bovino (SFB) com ACP® (de acordo com o fabricante), acrescidos ou não de células do cumulus. Os oócitos serão dispostos em placa de quatro poços, utilizando no meio da placa, água Mili-Q, durante 24 horas, em estufa de cultivo, a 38,5ºC, em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Ao final do processo, para avaliação da MIV os CCOs serão classificados em: (1) maduros com expansão das células do cumulus e expulsão do 1º corpúsculo polar (CP); (2) imaturos com expansão das células do cumulus, mas sem expulsão do 1º CP; e (3) imaturos sem expansão das células do cumulus e sem expulsão do 1º CP. Os oócitos considerados maduros serão ainda classificados de acordo com sua morfologia quanto ao grau de retração (presença ou ausência), coloração do ooplasma (homogêneo, levemente heterogêneo e heterogêneo) e picnose (presença ou ausência). Serão destinados à FIV aqueles avaliados como maduros com expansão das células do cumulus, expulsão do 1º corpúsculo polar e de qualidade morfológica. O sêmen utilizado na FIV será disposto em cima de uma coluna de gradiente de Percoll 45%/90%. Os espermatozoides móveis serão recuperados por duas centrifugações, a primeira a 700G, por 15 minutos e a segunda por 100G por 5 minutos. A concentração espermática será ajustada para 1x 106 espermatozoides/mL no volume total de 500μL/ gota. Os oócitos maturados seguirão para FIV, onde serão subdivididos em: Grupo A0 (fecundados sem ACP®) e Grupo A1 (fecundados com ACP®). No Grupo A0, os oócitos maduros serão incubados com os espermatozoides selecionados em SOF-FIV, contendo 40μg/mL de sulfato de gentamicina, 10 de SOE e 1 mg/mL de heparina; enquanto no Grupos A1 será utilizado o mesmo meio daquele utilizado no Grupo A0, porém acrescido ACP®. A FIV será realizada por um período de 22 horas, em incubadora, a 38,5ºC, com atmosfera umidificada contendo 5% de CO2. Os embriões serão avaliados com auxilio de um microscópio invertido (aumento 400X) para avaliação quanto à presença dos dois corpúsculos polares e/ou os dois pro-núcleos, após centrifugação a 12.100G por 30 minutos. Serão registradas as seguintes variáveis: Número de CCOs maduros; taxa de maturação oocitária (número de CCOs maduros/número de CCOs submetidos à MIV) x 100]; Proporção de oócitos (1) maduros com expansão das células do cumulus e expulsão do 1º corpúsculo polar (CP); (2) imaturos com expansão das células do cumulus, mas sem expulsão do 1º CP; e (3) imaturos sem expansão das células do cumulus e sem expulsão do 1º CP; Proporção de oócitos maduros com e sem retração; Proporção de oócitos maduros com e sem picnose; Proporção de oócitos maduros com ooplasma de coloração homogênea, levemente heterogênea e heterogênea. O número de presumíveis zigotos; A taxa de fecundação oocitária [(número de presumíveis zigotos/número de CCOs submetidos à FIV) x 100]. Os resultados serão expressos como média ± erro padrão ou em percentagem. Para comparação dos parâmetros, entre os grupos, será utilizada a Análise de Variância (ANOVA) one-way, seguida da realização do teste de Tukey. Os dados em porcentagem serão submetidos ao Teste de Fisher ou Qui-quadrado, por meio do software estatístico ASSISTAT (2011). As comparações serão consideradas significativas quando P<0,05. Até o presente momento foram coletados 80 ovários e criopreservados 200 oócitos, e estão em andamentos as coletas e a criopreservação, posterior a estas etapas serão realizados a maturação, fertilização e cultivo, com suas respectivas análises.
MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 1643184 - NEY ROMULO DE OLIVEIRA PAULA
Externo ao Programa - 2482066 - ANA LYS BEZERRA BARRADAS MINEIRO
Externo à Instituição - ROMULO JOSE VIEIRA - UESPI