Existe uma crescente busca por métodos eficazes e sustentáveis para controle de plantas daninhas baseada no fenômeno da alelopatia. Plantas com potencial alelopático inibitório emergem com uma fonte viável de novos herbicidas naturais. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito alelopático de lixiviados de Piper tuberculatum Jacq. sobre plantas daninhas e identificar os potenciais aleloquímicos liberados por esta via. Bioensaios in vitro foram realizados utilizando folhas de P. tuberculatum para avaliar a atividade dos lixiviados na germinação e crescimento inicial de Bidens bipinnata L. e Digitaria insularis (L.) Fedde, e os aleloquímicos foram caracterizados por metabolômica não direcionada baseada em espectrometria de massa e redes moleculares. A germinação e o desenvolvimento de plântulas das plantas daninhas foram significativamente afetados pelos lixiviados de P. tuberculatum, observando-se um aumento na inibição proporcionalmente ao aumento da biomassa de folhas de P. tuberculatum utilizadas no bioensaio. A maior inibição ocorreu com o uso de 200 mg de folhas por placa de Petri, atingindo valores de germinação e comprimento de parte aérea e raiz, respectivamente, de 84,5%, 97,9% e 97,42% para B. bipinnata e 83,25%, 77,87% e 87,76% para D. insularis, e demonstrando o uso dessa via de liberação como estratégia de comunicação de P. tuberculatum com outras plantas. A caracterização dos aleloquímicos revelou um total de 14 compostos pertencentes às classes dos alcaloides, ácidos graxos, compostos fenólicos, esteróides e terpenóides, com potencial envolvimento na atividade herbicida. Este é o primeiro trabalho envolvendo o estudo de vias de liberação de compostos alelopáticos de P. tuberculatum e fornece subsídios para o desenvolvimento de estratégias sustentáveis de controle de plantas daninhas baseados em aleloquímicos da via de lixiviação desta espécie vegetal.